氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測方法
摘 要
建立一種高(gāo)效液相色譜柱後衍生(shēng)法測定飼料中9種氨基甲酸酯類農藥（涕滅威砜、滅多(duō)威、3-羟基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威）殘留量的方法。樣品采用乙腈提取，氨基固相萃取柱分離淨化，濃縮，乙腈定容後，進行(xíng)反相色譜梯度洗脫分離、柱後衍生(shēng)化、熒光檢測器(qì)測定。結果表明(míng)，9種氨基甲酸酯類農藥在22min內(nèi)能實現基線分離，方法的回收率為(wèi)80.0%~110.0%，檢出限為(wèi)0.01 mg/kg，定量限為(wèi) 0.05 mg/kg。
關鍵詞：氨基甲酸酯類農藥；飼料；高(gāo)效液相色譜；柱後衍生(shēng)
氨基甲酸酯類農藥大(dà)量使用于玉米、大(dà)豆等主要飼料原料的農作(zuò)物生(shēng)産中,由于氨基甲酸酯類農藥毒性較大(dà)，通(tōng)過食物鏈傳遞,處于食物鏈終端的人(rén)類是最終的受害者,公衆健康安全受到威脅[1]。目前,該問題越來(lái)越被重視(shì),我國有(yǒu)關部門(mén)已于2003年制(zhì)定了《飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量測定氣相色譜法》[2]。但(dàn)是，由于氨基甲酸酯類農藥的極性和(hé)熱不穩定性，該方法測定靈敏度和(hé)重現性均不是十分理(lǐ)想[3-4]，因此，開(kāi)展氨基甲酸酯類農藥殘留量檢測技(jì)術(shù)的研究具有(yǒu)重要意義[5]。本文在查閱相關文獻的基礎上(shàng)[6-9]，研究了高(gāo)效液相色譜法測定飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量的可(kě)行(xíng)性，對飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留的測定方法進行(xíng)了研究，建立了一種高(gāo)效、準确的液相色譜測定方法。本方法靈敏度高(gāo)，穩定性好，适用于飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量的測定。
1.試驗部分
1.1 儀器(qì)
Waters 2695高(gāo)效液相色譜儀，配Waters2475熒光檢測器(qì)和(hé)柱後衍生(shēng)裝置；3k30型冷凍離心機（Sigma公司）；B-490旋轉蒸發儀(BüCHI公司);MS2minishaker旋渦混勻器(qì)(IKA公司)；AG-285電(diàn)子天平（Mettler公司）；20通(tōng)道(dào)固相萃取裝置（Waters公司）。
1.2試劑與材料
涕滅威砜、滅多(duō)威、3-羟基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威标準品均為(wèi)德國D.E.公司産品，純度≥96.0％；甲醇、二氯甲烷均為(wèi)分析純；乙腈為(wèi)色譜純；無水(shuǐ)硫酸鈉為(wèi)分析純；柱後衍生(shēng)試劑：0.05mol/l NaOH溶液和(hé)OPA衍生(shēng)試劑均購自美國Pickering公司；氨基固相萃取柱購自杭州富裕科技(jì)有(yǒu)限公司（500 mg/6 ml）。
1.3色譜條件
1.3.1 液相色譜柱條件
Waters Symmetry C18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5.0 μm；進樣量：20μl；流動相采用梯度洗脫，條件見表1，柱溫：35 ℃。
1.3.2 柱後衍生(shēng)條件
水(shuǐ)解溫度:85 ℃;堿液:0.05 mol/l；NaOH溶液,流速:0.3 ml/min;OPA試劑流速：0.3 ml/min；衍生(shēng)溫度:室溫。
熒光檢測器(qì):激發波長330 nm;發射波長465nm。
1.4 标準溶液配制(zhì)
1.4.1 OPA衍生(shēng)試劑配制(zhì)
準确稱取100 mg鄰苯二甲醛,用20 ml甲醇溶解,加入OPA稀釋液940ml,備用。另取巯基乙醇2.0 g用10 ml OPA稀釋液溶解，轉移至上(shàng)述溶液中，混勻，超聲脫氣，備用。
1.4.2農藥标準溶液配制(zhì)
1.4.2.1 單個(gè)農藥标準溶液
準确稱取适量農藥标準品（精确至0.1 mg），用乙腈溶解，配制(zhì)成1 000mg/l的單一農藥标準儲備液，貯存于-18 ℃以下冰箱中。使用時(shí)根據需要吸取适量标準儲備液用乙腈稀釋成标準工作(zuò)液。
1.4.2.2農藥混合标準溶液
準确吸取一定體(tǐ)積的單個(gè)農藥儲備液于同一容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制(zhì)成農藥混合标準儲備液,使用前用乙腈稀釋成所需濃度的标準工作(zuò)液。
1.5樣品處理(lǐ)
1.5.1 試樣制(zhì)備
實驗室樣品經混合均勻後,按四分法縮減至100 g,粉碎,使之完全通(tōng)過0.45mm篩孔，再充分混合，備用。
1.5.2 提取
準确稱取試樣（5±0.1） g置50 ml離心管中，加20 ml乙腈，渦旋1 min，6 000r/min離心5 min，分出上(shàng)清液，過無水(shuǐ)硫酸鈉，收集于茄心瓶中，剩餘物用20 ml乙腈重複提取一次，過無水(shuǐ)硫酸鈉，收集于同一茄心瓶中，50℃下旋轉蒸發至幹，備用。
1.5.3 淨化
用4 ml甲醇-二氯甲烷(體(tǐ)積比為(wèi)1：99)溶解茄心瓶內(nèi)物質,轉移至固相萃取柱(使用前用4ml甲醇-二氯甲烷平衡)中,收集流出液。再用4 ml甲醇-二氯甲烷(體(tǐ)積比為(wèi)1：99)洗茄心瓶,重複一次,收集洗脫液,在50℃減壓旋轉蒸發濃縮至幹,用乙腈定容至2.0 ml,過0.45 μm濾膜，上(shàng)機測定。
1.5.4 色譜分析
分别吸取20μl标準混合溶液和(hé)淨化後的樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間(jiān)定性，以峰面積定量。
2 結果與討(tǎo)論
2.1流動相的選擇
試驗中我們考察了甲醇-水(shuǐ)、乙腈-水(shuǐ)體(tǐ)系作(zuò)為(wèi)流動相對氨基甲酸酯類農藥的分離效果。結果發現，甲醇-水(shuǐ)、乙腈-水(shuǐ)可(kě)以對氨基甲酸酯類農藥實現分離，當乙腈-水(shuǐ)體(tǐ)系作(zuò)為(wèi)流動相時(shí)，待測物氨基甲酸酯類農藥的響應信号較強，分離效果更好，而甲醇-水(shuǐ)體(tǐ)系流動相的極性雜質較多(duō)，個(gè)别峰峰形不理(lǐ)想，幹擾較大(dà)，響應信号較低(dī)，故我們選擇乙腈-水(shuǐ)體(tǐ)系作(zuò)為(wèi)流動相，具體(tǐ)配比見表1。不同流動相體(tǐ)系圖譜比較見圖1，上(shàng)機液濃度為(wèi)200ng/ml。
2.2提取溶劑的選擇
由于氨基甲酸酯類農藥難溶于水(shuǐ),較易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有(yǒu)機溶劑。我們分别選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作(zuò)為(wèi)提取溶劑,在同一添加水(shuǐ)平,相同實驗條件下,對樣品進行(xíng)回收率試驗。試驗結果表明(míng),使用乙酸乙酯、丙酮的回收率明(míng)顯低(dī)于甲醇、乙腈作(zuò)為(wèi)提取劑的回收率,而甲醇使樣品基質幹擾較大(dà),圖譜基線漂移較大(dà),因此,本方法采用乙腈作(zuò)為(wèi)提取劑。
2.3固相萃取柱條件的選擇
根據查閱的資料，我們選擇了氨基固相萃取柱作(zuò)為(wèi)淨化柱，淨化樣品，洗脫劑選擇甲醇-二氯甲烷（1：99）,對洗脫劑的用量進行(xíng)了考察,結果表明(míng),回收率随洗脫劑體(tǐ)積增加而增加，當體(tǐ)積達到8ml(4 ml+4 ml)後，繼續增加洗脫液對回收率的影(yǐng)響不大(dà)。
采用以上(shàng)确定的前處理(lǐ)方法，進行(xíng)方法學考察，對配合飼料添加濃度為(wèi)40ng/g的樣品進行(xíng)檢測，所得(de)空(kōng)白樣品和(hé)添加樣品色譜圖見圖2。
2.4 線性方程和(hé)檢出限
配制(zhì)氨基甲酸酯類農藥濃度20.0~500μg/l的系列混合标準溶液，按1.3節建立的儀器(qì)條件進行(xíng)測定。分别以峰面積Y對含量X（μg/l）作(zuò)标準曲線，9種農藥的相關系數(shù)r均大(dà)于0.9995，在20.0~500 μg/l範圍內(nèi)具有(yǒu)良好的線性關系。以3倍信噪比為(wèi)檢出限(LOD)，9種待測農藥的檢出限達到0.01mg/kg，定量限（LOQ）為(wèi)0.05 mg/kg。
2.5回收率試驗
取同一批号的空(kōng)白配合飼料樣品，加适量混合标準工作(zuò)液，使加标量為(wèi)0.05、0.10、0.50mg/kg，按1.5節的方法處理(lǐ)後進行(xíng)儀器(qì)分析。每個(gè)濃度點取5份樣品，求其平均回收率，并計(jì)算(suàn)批內(nèi)相對标準偏差，結果詳見表2。
由表2的數(shù)據可(kě)知，飼料中9種氨基甲酸酯類農藥的加标量為(wèi)0.05、0.10、0.50mg/kg時(shí)，批內(nèi)相對标準偏差在11.5%以內(nèi)，平均回收率在80％以上(shàng)。在此基礎上(shàng)，把建立的方法應用于濃縮料、預混合飼料、單一飼料等樣品的測定，均取得(de)了滿意結果。
3結論
本文建立了以乙腈為(wèi)提取劑、經氨基固相萃取柱淨化、高(gāo)效液相梯度洗脫分離、熒光檢測器(qì)檢測，定性、定量測定飼料中9種氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法。該方法測定農藥種類較多(duō)，操作(zuò)過程簡單，測定結果準确，是測定飼料中氨基甲酸酯類農藥行(xíng)之有(yǒu)效的方法。