使用液相色譜和(hé)柱後光化學衍生(shēng)方法同時(shí)測定四種黃曲黴毒素
黃曲黴毒素是一種由真菌産生(shēng)的有(yǒu)毒的緻癌物質。這種真菌在合适的溫度濕度條件下會(huì)在土壤，谷物，堅果或腐爛的植物中生(shēng)長。自然界中自然産生(shēng)的黃曲黴毒素至少(shǎo)有(yǒu) 14 種之多(duō)，其中毒性最大(dà)的是黃曲黴毒素 B1。因此，很(hěn)多(duō)國家(jiā)和(hé)法規機構都對食物中黃曲黴毒素 B1 的含量做(zuò)了嚴格規定，通(tōng)常，對毒性比 B1 略小(xiǎo)的其他三種黃曲黴毒素 B2，G1 和(hé) G2 的含量也會(huì)做(zuò)出相應規定。例如歐盟規定黃曲黴毒素 B1 的在食物如谷物，堅果中的含量最大(dà)允許範圍在 2.0 到 8.0 µg/kg (ppb) 之間(jiān)，上(shàng)述四種黃曲黴毒素總含量允許值範圍在 4.0 到 15.0 µg/kg (ppb) 之間(jiān)。美國 FDA 規定食品含量限定值為(wèi) 20 µg/kg，飼料含量限值為(wèi) 300 µg/kg。中國國标GBT 18979-2003 規定四種黃曲黴毒素總量檢出限應為(wèi)1µg/kg。黃曲黴毒素測定通(tōng)常使用液相色譜-熒光檢測的方法完成。但(dàn)是由于有(yǒu)些(xiē)黃曲黴毒素在含水(shuǐ)流動相中會(huì)發生(shēng)熒光淬滅，所以需要采取一定的衍生(shēng)技(jì)術(shù)将它們衍生(shēng)為(wèi)不會(huì)淬滅的型态。目前應用比較普遍的衍生(shēng)方法是在溴的作(zuò)用下進行(xíng)柱後電(diàn)化學衍生(shēng)。這種方法有(yǒu)很(hěn)好的靈敏度，但(dàn)是也有(yǒu)很(hěn)多(duō)缺點，比如需要使用到對儀器(qì)有(yǒu)強烈腐蝕作(zuò)用的含溴流動相，并且衍生(shēng)裝置需要定期維護。
另一種衍生(shēng)方法是使用紫外光使黃曲黴毒素與水(shuǐ)進行(xíng)衍生(shēng)反應，由于水(shuǐ)是反相色譜中的常用溶劑，所以這種方法操作(zuò)十分簡便，并且在靈敏度上(shàng)與電(diàn)化學衍生(shēng)方法也有(yǒu)較好的可(kě)比性。在這篇應用報告中，我們在四元泵液相色譜系統上(shàng)開(kāi)發了一個(gè)靈敏快速的用于分析黃曲黴毒素 B1，B2，G1 和(hé)G2 檢測的柱後光化學衍生(shēng)-熒光檢測方法，這個(gè)方法在定量限和(hé)檢出限上(shàng)的表現完全可(kě)以滿足各個(gè)主要法規的要求。
儀器(qì)
液相色譜系統:
四元泵 (G1311B)
标準自動進樣器(qì) (G1329B)
柱溫箱 (G1316A)
(G1312B)，配置标準檢測池(8 µL)
• 柱後光化學衍生(shēng)裝置，柱後衍生(shēng)裝置串聯于色譜柱出口與熒光檢測器(qì)入口之間(jiān)
色譜柱
免疫親和(hé)小(xiǎo)柱C18
溶劑和(hé)試劑
溶劑
甲醇 (HPLC 級)
标準品
黃曲黴毒素标準品 (99%+ B1: 1.055 µg/mL, B2: 0.327 µg/mL,
G1: 1.082 µg/mL and G2: 0.309 µg/mL 溶解于甲苯/乙腈 (98:2))
加标玉米粉樣品為(wèi)在樣品前處理(lǐ)前 向上(shàng)述玉米粉樣品中加入相當于标準曲線級别 4 的标準品（濃度數(shù) 值見表 1）。
标準添加玉米粉樣品（含有(yǒu) 9.00 ppb B1 和(hé) 0.6 ppb
B2）。
芝麻醬樣品（含有(yǒu) 4.57 ppb B1，其他三
種濃度未知）。
酸棗仁樣品（2010 版中國藥典規定進行(xíng)
黃曲黴毒素檢測）。
樣品和(hé)标準品制(zhì)備
标準溶液配制(zhì)：取 10 µL 标準品溶液置于 10 mL 瓶中，室溫下氮氣
吹幹，用甲醇-水(shuǐ)溶液 (50:50, v:v) 複溶，之後稀釋成如下濃度作(zuò)為(wèi)
标準曲線不同濃度點
| 表 1. 濃度級别 | ||||||
| 濃度級别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| B1 | 0.1055 | 0.2638 | 0.5275 | 1.055 | 5.275 | 10.55 |
| B2 | 0.0327 | 0.0818 | 0.1635 | 0.327 | 1.635 | 3.27 |
| G1 | 0.1082 | 0.2705 | 0.541 | 1.082 | 5.41 | 10.82 |
| G2 | 0.0309 | 0.0772 | 0.1545 | 0.309 | 1.545 | 3.09 |
樣品處理(lǐ)：取 5g 樣品（見表 2）和(hé) 0.5 g 氯化鈉置于 50 mL 離心管中，加入 25 mL 甲醇-水(shuǐ)溶液 (70:30, v:v)，高(gāo)速勻漿 1 分鍾，5000 轉離心 5 分鍾，取 5 mL 上(shàng)清液，加入 15 mL 水(shuǐ)，轉移全部的 20 mL 溶液經過免疫親和(hé)小(xiǎo)柱淨化：
| 樣品 | 玉米粉 | 加标玉米粉 | 标準添加玉米粉 | 芝麻醬 | 酸棗仁 |
| 重量 (g) | 5.03 | 5.00 | 4.99 | 4.96 | 4.98 |
免疫親和(hé)小(xiǎo)柱淨化過程：1. 用 2 mL 超純水(shuǐ)活化小(xiǎo)柱2. 将要淨化的樣品加入到小(xiǎo)柱上(shàng)，控制(zhì)流速在 1 滴/秒(miǎo)，使樣品溶液流過小(xiǎo)柱3. 用 10 mL 超純水(shuǐ)清洗小(xiǎo)柱，棄去洗脫液4. 用注射器(qì)打氣排空(kōng)小(xiǎo)柱大(dà)概 10 秒(miǎo)以排幹小(xiǎo)柱內(nèi)的殘留液體(tǐ)5. 使用 0.5 mL 甲醇以 1 滴/秒(miǎo)的速度洗脫小(xiǎo)柱，确保洗脫全部黃曲黴毒素6. 用注射器(qì)打氣排空(kōng)小(xiǎo)柱收集全部洗脫液7. 向洗脫液中加入 0.5 mL 超純水(shuǐ)，渦旋混勻8. 0.22 µm 濾膜過濾
色譜條件色譜柱: C18, 3.0 x 50 mm, 2.7 µm(p/n 699975-302)流動相: 水(shuǐ)/甲醇 65:35 (v:v), 等度停止時(shí)間(jiān): 13.5 min流速: 0.4 mL/min進樣量: 10 µL柱溫: 30 °C檢測器(qì)參數(shù): Ex.: 365 nm, Em.: 440 nm, 采樣頻率: 1.16 Hz, 增益: 10
結果
使用上(shàng)述方法對四種黃曲黴毒素标準品（第 4 級濃度，藍(lán)色圖）進行(xíng)了分析并與空(kōng)白進樣（紅色）進行(xíng)了比較，結果見圖 1，根據色 譜圖可(kě)以看到四種黃曲黴毒素可(kě)以在 13.5 分鍾內(nèi)達到良好的基線 分離。圖中可(kě)以看到色譜峰有(yǒu)較大(dà)展寬，這主要是由于樣品經過光衍生(shēng)裝置中的衍生(shēng)管造成的，為(wèi)了保證足夠的反應時(shí)間(jiān)，不能使用很(hěn)高(gāo)的流速，這導緻了樣品峰在管線中的擴散。
峰面積和(hé)保留時(shí)間(jiān)重現性
對标準品（濃度級别 4）進行(xíng)了 6 次重複的分析考察峰面積及保留時(shí)間(jiān)的重現性，結果顯示保留時(shí)間(jiān) RSD% 均小(xiǎo)于 0.15%，峰面積RSD% 均為(wèi) 0，峰面積重現性良好也表明(míng)衍生(shēng)效果穩定，定量結果可(kě)靠。具體(tǐ)結果見表 3
檢出限(LOD) 和(hé)定量限(LOQ)
用濃度級别1 與濃度級别2 的标準品分别進樣分析以考察檢出限(LOD) 和(hé)定量限 (LOQ)（圖 2a 和(hé) 2b），結果按照信噪比進行(xíng)折算(suàn)， LOD 取S/N=3 的濃度，LOQ 取S/N=10 的濃度，結果見表4。結果顯示，此方法的檢出限與定量限可(kě)以完全滿足國标GBT 18979-2003 的要求。
圖2. 2a (上(shàng)) ，2b (下): 檢出限(LOD) 和(hé)定量限(LOQ)
線性
五個(gè)不同濃度的标準品（濃度級别 2〜6）進樣分析以考察線性 （圖 3），4 種黃曲黴毒素的線性相關因子 R 均 >0.999，結果總結于 表 5 中：
圖3. 5 個(gè)不同濃度标準品色譜圖重疊(濃度級别2〜6)
樣品分析
回收率分别使用标準品和(hé)加标樣品按照相同前處理(lǐ)步驟和(hé)測定方法進行(xíng)處理(lǐ)和(hé)測定以考察前處理(lǐ)和(hé)方法回收率，結果總結于表 6 中，可(kě)以看到标準品和(hé)加标樣品測得(de)的回收率值有(yǒu)很(hěn)好的一緻性，證明(míng)基質不會(huì)影(yǐng)響回收率，回收率數(shù)值在 55〜75% 之間(jiān)，比免疫親和(hé)小(xiǎo)柱說明(míng)書(shū)中報告的值 (70〜110%) 略低(dī)。
圖 4 為(wèi)玉米粉樣品與加标的玉米粉樣品（濃度級别 4）色譜圖的比較，将标準品加在樣品處理(lǐ)前加入玉米粉當中，按照本報告前面叙述的前處理(lǐ)步驟進行(xíng)處理(lǐ)。結果顯示，未加标的玉米粉樣品中不含有(yǒu)黃曲黴毒素，在加标樣品中，我們可(kě)以看到目标組分與基質幹擾峰有(yǒu)良好的分離。
圖 5 為(wèi)加标玉米粉樣品（紅色）和(hé)标準加入玉米粉樣品（藍(lán)色），标準加入玉米粉樣品中含有(yǒu) B1 ：9.00 ppb，B2：0.6 ppb。
圖 6 為(wèi)含有(yǒu)四種黃曲黴毒素的芝麻醬樣品，可(kě)以看到，對于不同基質，此方法也可(kě)以保證目标化合物與基質幹擾峰得(de)到良好的分離。
圖5. 加标玉米粉樣品（紅色）和(hé)标準加入玉米粉樣品（藍(lán)色）
圖6. 芝麻醬樣品
酸棗仁是一種常見中藥，有(yǒu)鎮靜安神，鎮痛，降低(dī)血壓等作(zuò)用，收載于中國藥典 2010 版一部[9]當中，在“檢查”項中要求對黃曲黴毒素進行(xíng)測定。
圖 7 為(wèi)酸棗仁樣品（藍(lán)色）和(hé)标準品（紅色）的色譜圖，可(kě)以看出，被分析的酸棗仁樣品當中不含有(yǒu)黃曲黴毒素。
圖7. 酸棗仁樣品（藍(lán)色）和(hé)黃曲黴毒素标準品（紅色）
不同樣品的定量測定結果見表7.
考慮到回收率的影(yǐng)響，這些(xiē)結果與确定含量的樣品的真實含量相吻合，表明(míng)此方法定量結果可(kě)靠。
討(tǎo)論
我們開(kāi)發了一個(gè)使用簡單的柱後光衍生(shēng)設備及熒光檢測同時(shí)測定食品基質中黃曲黴毒素 B1，B2，G1，G2 的方法。方法線性及重現性良好，在檢出限和(hé)定量限上(shàng)完全可(kě)以滿足現行(xíng)法規的要求，根據對實際樣品的測試，此方法可(kě)以很(hěn)好的 将被測成分與基質幹擾峰分離。比起電(diàn)化學柱後衍生(shēng)方法，所需要的設備簡單，而且避免了使用對于儀器(qì)損害嚴重的流動相添加劑。雖然光化學衍生(shēng)的方法比電(diàn)化學衍生(shēng)法的靈敏度略低(dī)，但(dàn)是仍舊(jiù)可(kě)以很(hěn)好的滿足現行(xíng)法規和(hé)标準的要求。