藥典中為(wèi)什麽選擇HPLC-柱後衍生(shēng)法測試氨基酸？

2020年版中國藥典收載了5種複方氨基酸注射液、9種多(duō)肽類藥物及1種中藥品種，均需要采用氨基酸分析方法測定藥品中氨基酸含量或氨基酸組成。為(wèi)了指導藥典标準執行(xíng)過程中如何選擇适宜的方法，國家(jiā)藥典委員會(huì)委托中檢院牽頭承擔完成了“藥品中氨基酸分析法的建立課題”，拟定了中國藥典氨基酸分析指導原則，填補之前藥典中關于選擇測試方法的空(kōng)白。

這麽多(duō)的檢測方法應該如何選擇？

蛋白質和(hé)多(duō)肽的氨基酸分析，需要将樣品先水(shuǐ)解成遊離的氨基酸才能進行(xíng)分析。由于氨基酸本身并沒有(yǒu)發色集團或熒光基團，所以遊離氨基酸通(tōng)常需要衍生(shēng)化才能測定。藥品中氨基酸測定常用方法一共有(yǒu)6種，分别是：
① 柱前PITC衍生(shēng)氨基酸測定法；
② 柱前AQC衍生(shēng)氨基酸測定法；
③ 柱前OPA和(hé)FMOC衍生(shēng)氨基酸測定法；
④ 柱前DNFB衍生(shēng)氨基酸測定法；
⑤ 柱後茚三酮衍生(shēng)氨基酸锂離子交換系統測定法；
⑥ 柱後茚三酮衍生(shēng)氨基酸鈉離子交換系統測定法。


按照衍生(shēng)順序可(kě)分為(wèi)柱前衍生(shēng)和(hé)柱後衍生(shēng)
柱前衍生(shēng)法
原理(lǐ)：根據氨基酸與衍生(shēng)試劑反應，生(shēng)成有(yǒu)紫外吸收的衍生(shēng)物，後經反相液相色譜分離後用紫外檢測器(qì)在一定波長處檢測，在一定的濃度範圍內(nèi)其響應值與氨基酸濃度成正比；
優點：對儀器(qì)配置要求不高(gāo)，實驗成本低(dī)。
缺點：某些(xiē)衍生(shēng)物不穩定，無法定量，分離效果一般。


柱後衍生(shēng)法
原理(lǐ)：通(tōng)過調節系統pH值及離子強度，采用锂/鈉離子交換系統，實現離子交換色譜柱對混合氨基酸的分離，經離子交換色譜分離的氨基酸與茚三酮反應，一級氨基酸生(shēng)成紫色化合物，在570nm波長處有(yǒu)最大(dà)吸收。二級氨基酸（如脯氨酸）生(shēng)成黃色化合物，在440nm波長處有(yǒu)最大(dà)吸收。在440nm和(hé)570nm波長處分别檢測，在一定的濃度範圍（20～500pmol）內(nèi)，氨基酸衍生(shēng)化産物的吸光度與氨基酸濃度成正比；
優點：自動化程度高(gāo)，不易受基質幹擾。
缺點：針對《氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）》提到的采用柱後茚三酮衍生(shēng)氨基酸锂離子交換法，分析時(shí)間(jiān)長，異亮氨酸和(hé)亮氨酸間(jiān)的分離難以達到要求。改善建議采用溫度梯度可(kě)以改善分離效果。

氨基酸分析解決方案

1、環能時(shí)代公司參照歐洲藥典8.0，提供了完整的氨基酸分析解決方案——

方案包括 柱後衍生(shēng)儀、色譜柱和(hé)保護柱、緩沖液和(hé)茚三酮衍生(shēng)試劑。

可(kě)以修改運行(xíng)條件，執行(xíng)溫度梯度程序，縮短(duǎn)運行(xíng)時(shí)間(jiān)加速氨基酸分離,符合歐洲藥典8.0的系統适用性要求,（亮氨酸和(hé)異亮氨酸分離度要大(dà)于1.5）。

2、分析條件：
色譜柱：高(gāo)效鈉離子交換柱 4.6*110mm，貨号1154110T；
流速:0.6mL/min；
流動相:見表2；
進樣體(tǐ)積:50ul；

3、柱後衍生(shēng)條件：
柱後衍生(shēng)系統:Onyx PCX；
反應器(qì)體(tǐ)積:0.5mL；
試劑:Trione®茚三酮 ；
反應溫度:130ºC；
柱溫:見表3；
流速:0.3 mL/min；
檢測波長:UV/Vis 570nm一級氨基酸；440nm二級氨基酸。

4、結論：
今年3月份發布的針對《氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）》中，以歐洲藥典為(wèi)參照,填補了我國2020版藥典之前對氨基酸分析指導意見的空(kōng)白，詳細的闡述了幾個(gè)常用方法的原理(lǐ)以及特點。Pickering參照歐洲藥典8.0，提供完整解決方案，HPLC+Onyx PCR 即可(kě)實現藥典中提到的柱後茚三酮衍生(shēng)氨基酸锂離子交換系統測定法和(hé)柱後茚三酮衍生(shēng)氨基酸鈉離子交換系統測定法，完美實現方法擴增。
引用：氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）